王新军1 ,赵忠伟2,刘泉1，寿纪新1，李培栋1，单峤1
Expression Level and Clinical Significance of Bcl-XL Gene in Medulloblastoma
Wang Xin-jun1 , ZHAO Zhong-wei2, LIU Quan1, SHOU Ji-xin1,LI Pei-dong1,SHAN Qiao1
1.Department of Neurosurgery,Zhengzhou Railway Central Hospital, Zhengzhou 450052 , China;2.Henan Key Laboratory of Tumor Pathology, Zhengzhou 450052 , China;
Abstract: Objective To discussion the expression level and clinical significance of bcl-xL in medulloblastoma. Methods The expression of bcl-2 protein and bcl-2 mRNA were determined by immunohistochemical staining method and in situ hybridization in 61 samples of human glioma tissues, as well as 20 normal brain tissues. Results The positive rates of bcl-2 protein(90.2%) and bcl-2 mRNA (95.1%) in glioma group was significantly higher than those in human normal brain tissues (P<0.01), and a significant correlation was found between bcl-2 protein and bcl-2 mRNA expression level , between bcl-2 expression level and pathological grading(P<0.01). Conclusion High bcl-2 expression was prevalent in malignant glioma tissure,and the bcl-2 expression level was a close correlation with the clinical prognosis.
Key words: Medulloblastoma；Bcl-xL；immunohistochemical ；in situ hybridization
摘 要: 目的 探讨bcl-xL基因在正常脑组织和髓母细胞瘤组织中的表达水平及其临床意义。方法 应用免疫组化染色和原位杂交方法对21例髓母细胞瘤和20例正常人脑组织中bcl-xL蛋白和bcl-xL mRNA表达水平进行检测。结果 与正常人脑组织相比，髓母细胞瘤组织中免疫组化染色90.4%（19/21）表达bcl-xL蛋白，原位杂交显示100%(21/21)表达bcl-xL mRNA， bcl-xL在转录水平的表达明显高于蛋白质水平，两者呈正相关。bcl-xL表达水平正常人脑组织显著低于髓母细胞瘤(均P<0.01)。结论 凋亡抑制基因bcl-xL在正常脑组织中和髓母细胞瘤组织中的不同表达说明该基因在髓母细胞瘤细胞凋亡中发挥重要作用。
关键词：脑髓母细胞瘤；bcl-xL基因；免疫组织化学；原位杂交
中图分类号R734.7
0 引言
Bcl-xL基因是Bcl-2基因家族的一个重要的凋亡抑制基因，该基因首先在小鼠B细胞淋巴瘤中被发现，故称Bcl-2 (B-cell lymphoma/leukemia-2). 以往对于Bcl-2基因的研究主要集中在他们对于整个细胞凋亡过程的调控，但近年来人们发现，Bcl-2基因及其蛋白有着更为广泛的作用，他们的过表达及其磷酸化也参与细胞增生的调控，并且在多种肿瘤的形成和肿瘤的多药耐药中起着置关重要的作用[3-5]。但未发现对髓母细胞瘤的研究，因此，本研究采用免疫组化染色和原位杂交的方法对21例髓母细胞瘤组织和20例正常脑组织中bcl-xL表达进行检测，来探讨髓母细胞瘤组织中bcl-xL表达的临床意义，现将结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 病例与组织标本来源
收集我院2000年1月到2002年12月手术切除的新鲜髓母细胞瘤标本21例，其中男13例，女8例，年龄8～47岁，平均14.1±2.4岁。全部标本均经病理确诊，按WHO分级，Ⅰ级10例，Ⅱ级9例，Ⅲ级22例，Ⅳ级20例。另随机选取20例同期颅脑损伤患者手术获得的无神经系统肿瘤的正常脑组织标本作正常对照,对照组男性16例，女性4例，年龄21～51岁，平均37.9±4.2岁。标本收集时，取中心部位无出血坏死组织，一部分用4%甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚连续切片备用。另取部分立即用冷冻包埋剂(OCT)包埋，液氮快速冷冻，-70℃冰箱保存。
1.2 实验方法
1.2.1 bcl-xL蛋白的免疫组织化学染色
兔抗人bcl-xL蛋白多克隆抗体购于博士德生物工程公司，SP法免疫组织化学染色试剂盒购于北京中山生物技术公司。实验过程严格按照随试剂所附的说明要求操作进行。组织切片经常规脱蜡、水化后，放入0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中预处理，经微波加热（92～98℃）10 min，冷却到室温后用单克隆Ⅰ抗SP 法标记bcl-2蛋白（1∶60）。用已知阳性表达切片做阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照。结果判定：背景无颜色，胞浆内着棕黄色颗粒为阳性细胞。（﹣）没有阳性信号；（﹢）弱阳性，阳性细胞＜25%；（﹢﹢）弱阳性，阳性细胞介于25%-50%；（﹢﹢﹢）强阳性，阳性细胞50%-75%；（﹢﹢﹢﹢）强阳性，阳性细胞＞75%。
1.2.2 bcl-xL mRNA原位杂交检测
经地高辛标记的bcl-xL探针及检测试剂盒均购自北京奥克公司。组织切片经常规脱蜡、水化，预处理后，蛋白酶K消化30min,预杂交2-4h,杂交及杂交后检测程序均严格按该试剂盒说明进行。空白对照加不含探针的杂交液作为阴性对照。结果判定同上。
1.3 统计学处理
采用SPSS10.0对相应数据进行Ⅹ2检验、t-检验、F-检验及直线相关分析和等级相关分析，以α=0.01作为检验水准。
2 结果
2.1 bcl-xL蛋白的免疫组化染色
bcl-xL蛋白阳性胶质瘤细胞呈棕黄色，弥漫于细胞质中(见图2)。20例正常脑组织中仅4例（20.0%）表达bcl-xL蛋白，61例胶质瘤中，有55例(90.1%)不同程度的表达bcl-xL蛋白，其阳性率随肿瘤级别升高而相应递增。除Ⅰ、Ⅱ级组间差异不十分显著外，其他组间差异均有显著性见表1。
表1 免疫组化检测bcl-xL 蛋白表达结果
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组别 例数 阳性数（%） |
强度例数（%） |
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﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢﹢ |
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正常脑组织 21 3(15.0) 2(66.7) 1(33.3) 0 0
髓母细胞瘤 20 19(90.4) 1(5.3) 1(5.3) 2(10.6) 17(89.4) |
注：经两两比较t检验证实5组间P<0.01～0.001
2.2原位杂交
bcl-xL mRNA阳性胶质瘤细胞呈棕黄色颗粒均匀着色，主要位于细胞质中(图1)。61例胶质瘤中，有58例(95.1%)不同程度地表达bcl-xL mRNA，其阳性率总体上随肿瘤级别升高而相应增加，除Ⅰ、Ⅱ级组间差异不明显外，三组间差异均有显著性。20例正常脑组织中bcl-2 mRNA 表达水平显著低于胶质瘤组见表2。
表2 原位杂交检测bcl-2 mRNA 表达结果比较
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组别 例数 阳性数（%） |
强度例数（%） |
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﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢﹢ |
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正常脑组织 20 3(15.0) 2(66.7) 1(33.3) 0 0
髓母细胞瘤 21 21(100) 0 1(7.0) 1(4.7) 19(90.5) |
注：经两两比较t检验证实5组间P<0.02～0.001
2.3 胶质瘤组织中bcl-2蛋白与bcl-2 mRNA之间的关系
Bcl-2在蛋白质水平和转录水平表达结果比较见表3，经等级相关分析证实，bcl-2 mRNA和蛋白表达的等级间呈显著性正相关(rs=0.987,P<0.01)。
表3 bcl-2在蛋白质水平和转录水平表达结果比较
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组别 例数 总阳性数（%） |
强度例数（%） |
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﹣ ﹢ ﹢﹢ ﹢﹢﹢ ﹢﹢﹢﹢ |
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免疫组化 61 55(90.2) 6(9.8) 11(18.1) 15(24.6) 13(21.3) 15(23.8)
原位杂交 61 58(95.1) 3(4.9) 13(21.3) 17(27.9) 12(19.7) 16(50.0) |
图1胶质母细胞瘤免疫组化bcl-2表达 图2胶质母细胞瘤原位杂交bcl-2表达
图1 免疫组化bcl-2蛋白在多形性胶质母细胞瘤中的表达，阳性物质为棕黄色，主要位于细胞质中，S-P法,DAB染色，苏木素复染（bcl-2强表达×400）
图2原位杂交bcl-2 mRNA在多形性胶质母细胞瘤中的表达，强表达×400（DAB染色，阳性物质为棕黄色颗粒，主要位于细胞质中） |
